◆国産メシマコブ
(PL-08) 菌株の特徴
国内で採取した野生メシマコブの遺伝子解析を行い、メシマコブであると同定した後、各系統間における個々の野生株の特性をより明確に把握するため、分子レベルでの比較として、地理的に離れた自然集団におけるメシマコブのミトコンドリアDNA（mtDNA）での制限酵素断片長多型（RFLP）解析を行い、遺伝的変異性の調査、およびメシマコブ種内の個体群分けを検討しました。次に、効率良くメシマコブ由来の有用な成分を獲得するために、大型タンク（図2）を用いた工業規模で菌糸体（図3）を獲得した上で各種薬理試験を行いました。まず予防医学の観点から生体系における老化や発ガンの原因となるスーパーオキシドアニオンラジカルの消去活性試験に関して、メシマコブ菌糸体由来成分から活性成分を単離し、化学構造解析を行いました。さらに、メシマコブ菌糸体由来成分を用い、動物による一般毒性試験、抗アレルギー試験（NC/Nga.,/mice）および抗腫瘍試験（Sarcoma
180/mice, p.o.法）を試みました。また、抗アレルギー試験のひとつの指標としてのヒスタミン遊離抑制試験を行い、活性物質の単離・同定を行いました。最後に、現在社内で試験中の抗腫瘍活性に関連したHL-60細胞（ヒト骨髄性白血病由来細胞）を用いた細胞増殖抑制およびアポトーシス誘導能の調査を行い、これらの各種薬理作用におけるメシマコブ菌糸体成分の有用性を評価しました。
現段階の報告は、DNA解析による裏付けからメシマコブであると同定した菌株を用い、大型タンクによる大量培養から獲得した菌糸体の薬理活性試験に関して、専門的な見識を有する各大学機関（静岡大学・近畿大学・北里大学・山梨大学・信州大学）と当社（㈱アイ・ビー・アイ
応用キノコ研究所）との共同研究から得られた内容です。 |
図２a 液体培養タンク
図２b 培養中のメシマコブ菌糸体
図３a 表面培養メシマコブ菌糸体
 図３b メシマコブ菌糸体の電子顕微鏡画像 |
◆遺伝子解析と優良菌株の選定
日本産野生メシマコブ 9 系統および韓国で人工栽培されている2系統に関して、ITS-5.8S
rDNAの塩基配列を調べ、BLAST検索から登録菌種との比較を行いました。今回の結果では、日本産野生メシマコブ
9 系統全てがメシマコブ（Phellinus linteus ）であると同定され、韓国人工栽培菌種2系統はエゾキコブタケ（Phellinus
baumii ）でした。次に、日本産野生メシマコブ 9 系統に関して遺伝的変異性を検討するために、ミトコンドリア
DNA（mtDNA）の制限酵素断片長多型（RFLP）分析を行いました。9 系統からそれぞれ単離したmtDNA
を制限酵素（BamHI、EcoRI）分解したところ、9系統の mtDNA は 5 種類の異なる遺伝子型に類別できました。メシマコブの
mtDNA のサイズは73.0～81.5kbでした。遺伝子型の異なる5種のメシマコブを用い、菌糸体培養および抗腫瘍活性試験を行ったところPL-08菌株において最も高い活性を示しました。この高い活性を示したPL-08菌株のmtDNAサイズは74.0kbであり、以降の試験では、この供試菌を用いて試験を行いました。
この試験において、日本産の桑の古木に寄生した硬質系キノコは、全て真正のメシマコブであると同定されました。mtDNAのRFLP分析では、国内種メシマコブの全てではないが、個体群分けが可能であると考えられます。また、メシマコブのmtDNAのサイズは73.0～81.5kbであることが示唆され、最も有用な菌株はPL-08であることがわかりました。菌糸体培養を行う上で、使用する菌株が真正なものである点、また種内において優良な菌株を選抜する点、以上の点をベースにして試験を進めることが重要であり、今回の試験からもDNAレベルで十分な裏付けを得た上で、各種の試験を行う必要があると考えます。 |
◆抗酸化作用
| Hypoxanthine,
Xanthine oxidase 系を用い、トラップ剤DMPO（5, 5-dimethyl-1-pyrroline
N-oxide）でトラップしたスーパーオキシドアニオンラジカル（O2.-）をESR（JES-FR100）装置により測定し、各成分を添加することでその消去活性（以降スーパーオキシド消去活性）を調査しました。まず初めに、12種類（ヒメマツタケ、マイタケ、マンネンタケ、ヤマブシタケ、シイタケ、ハタケシメジ、ホンシメジ、カンゾウタケ、ヌメリスギタケモドキ、エリンギ、ナメコ、メシマコブ）のキノコ菌糸体培養成分を用いて調査した結果、メシマコブ（PL-08株）が最も高い活性を示しました。 |
| さらに、メシマコブ菌糸体成分の活性画分を探索するため、各種分画操作を行い、EtOAc画分に活性が認められました。さらに細分画を行ったところ、極性が強い画分に高い活性が認められました。この活性画分を細分画した結果、Caffeic
acid（図４） を単離することに成功しました。この成分のスーパーオキシド消去活性はIC50：3.05mg/mL（16.9mM）であり、抗酸化物質として知られているビタミンCの約2倍の消去活性を有することが示唆されます。高等菌類であるキノコ由来菌糸体からCaffeic
acidを発見したことは初めての成果です。このCaffeic acidは、メシマコブにおける薬理作用の一端を担っていると考えられます。 |
図４ Caffeic acid の構造 |
| また、活性酸素種としてスーパーオキシドと同様に注目されているヒドロキシルラジカル（・OH）の消去活性に関して、上記12種のキノコ菌糸体成分におけるESR装置を用いた消去活性を調査した結果、メシマコブは最も高い値を示したヤマブシタケと同等の消去活性を示しました。これらの結果から、メシマコブ菌糸体成分中には様々な活性酸素種に対して抗酸化作用を示す成分が多く含まれていると考えられます。 |
◆一般毒性試験及び抗アレルギー作用
I型アレルギーの抑制効果を試験するために、アトピー性皮膚炎を自然発症するマウスを用いてメシマコブ菌糸体熱水抽出成分と培養濾液成分について試験しました。メシマコブ菌糸体由来成分を経口投与することによってIgE値の上昇が緩和され、血中IgEの産生抑制や皮膚アレルギー症状の抑制作用が認められました。特に、熱水抽出成分に顕著な効果が認められ、これは水溶性高分子が抗アレルギー作用の発現に関わっているものと推察されます。
また、メシマコブ菌糸体成分中の活性成分の単離・同定を試みるため、ヒスタミン遊離抑制作用を検討したところ、熱水抽出成分を更にアルコール抽出した成分に活性が見られました。結果としては、ヌクレオシドのアデノシンとN-ヒドロキシ-N-メチル-アデノシンを単離・同定することに成功し、これら成分のヒスタミン遊離抑制率はそれぞれ30%,
27%でした。また、これらは市販のインタール試薬を上回る活性を示しました。これらの結果からメシマコブ菌糸体成分は生体内のIgE値の抑制とヒスタミン遊離の抑制のダブル効果が期待されますので、国民病として拡大が予想されるアレルギー予防に対する一つの手段として用いることが出来ればと考えております。 ○また安全性に関しましては、動物を用いた一般毒性試験により評価を行い、メシマコブ菌糸体成分を経口投与した場合2,000mg/kg以下の用量においては毒性の兆候は見られず、安全性が確認されています。
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図５ メシマコブ菌糸体成分を与えたNC/Nga.,マウスにおける血中IgE量の経時変化 |
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◆ヒスタミン遊離抑制作用
本研究は近畿大学農学部の駒井功一郎教授との共同研究の成果で、2003年度の日本農芸化学会大会で発表した内容の抜粋です。
アレルギーに関連した試験としてヒスタミン遊離抑制作用に関する調査があります。ここでは、ラット腹腔内由来マスト細胞を用いたヒスタミン遊離抑制試験を行い、メシマコブ菌糸体成分中における活性成分の単離・同定を試みたので報告します。まず、動物実験においてメシマコブ菌糸体熱水抽出成分の有用性が示されていることに着目し、分画サンプルの調製を行いました。メシマコブ菌糸体の熱水抽出成分をアルコール画分と水画分に分けて試験を行った結果、アルコール画分において活性が認められました。さらに、液体クロマトグラフィーを用いて細分画を行いました。結果としては、ヌクレオシドのアデノシンとN-Hydroxy-N-methyl-adenosineを単離・同定することに成功しました。これら成分のヒスタミン遊離抑制率（添加濃度5μg/mL）はそれぞれ30%、27%でした。また、市販のインタール試薬と比較した結果、アデノシンおよびN-Hydroxy-N-methyl-adenosineはインタールを上回る活性を示しました。
このヒスタミン遊離抑制試験は、動物実験における血中IgE値の抑制効果に対する直接的な関連性はないと思われますが、アレルギー症状の末端で誘発される炎症（痒み等）に対しての抑制効果を示す可能があると考えます。
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◆抗腫瘍作用（in
vivo)
メシマコブ菌糸体由来成分中の生体内に及ぼす効果を調査する目的で、被験材料を菌糸体熱水抽出成分および培養濾液に分け動物試験を行いました。Sarcoma-180固形癌移植モデルマウスを用いた腫瘍抑制効果の結果は、メシマコブ菌糸体熱水抽出成分および培養濾液の両者で抗腫瘍活性はそれぞれ75.4%、62.2%と高い値を示しました。特に、菌糸体熱水抽出成分では、NK細胞活性が2.2倍、IFN-γが約3倍およびTNF-αが約2倍の活性を示しました（図7）。以上の結果からメシマコブ菌糸体熱水抽出成分は、マウス生体内の免疫機能を賦活することで、抗腫瘍効果を示すことが示唆されます。
次に、活性成分を調査することを目的として、アルコール・熱水・アルカリ（4%NaOH、24%NaOH）の各抽出を段階的に行い、抗腫瘍活性を調べました。結果としては、メシマコブ菌糸体の全ての画分において活性に強弱はあるものの抗腫瘍活性が認められました。特に、最も高い抗腫瘍活性率81.2%は、24%NaOH抽出におけるpH6.0調整の沈殿物として獲得した糖タンパク複合体に認められました。この糖タンパク複合体は、糖質39.3%、蛋白質49.4%の構成でした。13C-，1H-NMR解析によって、この複合体の主要な糖部分はα-1,3-グルカンと判明しました。 |
図７ メシマコブ菌糸体成分投与におけるNK細胞活性・IFN-γ・TNF-αへの効果 |
◆抗腫瘍作用 (in
vitro)
| メシマコブ菌糸体由来成分のHL-60細胞（ヒト骨髄性白血病由来細胞）への細胞増殖抑制およびアポトーシス誘導能の調査を染色後の顕微鏡観察およびDNA断片化の有無により確認しました。動物実験と同様にアルコール・熱水・アルカリにおける各抽出を段階的に行い、各試験に供試しました。結果としては、アルコール抽出成分およびアルカリ（24%NaOH）抽出成分において細胞の増殖抑制効果が認められました。特に、アルコール抽出成分が最も高い抑制効果を示し、アポトーシス誘導の裏付けであるDNAの断片化（図8）および核の凝集も観察されました（図9）。アルコール抽出成分（添加濃度800μg/mL）の細胞増殖抑制率は70.4%でした。アルコール抽出成分に比べて低い活性でしたが、動物実験において最も高い抗腫瘍活性を示したアルカリ（24%NaOH）抽出成分においても腫瘍細胞の増殖抑制およびアポトーシスの誘導が観察されました。動物実験と今回の腫瘍細胞における細胞増殖抑制効果は直接的な関連性があるか否かの裏付けは現段階では得られていません。しかし、主要成分が糖タンパクであるアルカリ抽出成分において、腫瘍細胞に対して直接的な細胞増殖抑制を示したことは興味深い結果です。今後は、さらにこれらの関連性を調査する予定です。また、現在様々なヒト由来腫瘍細胞を準備し、各種臓器別の腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制効果、ならびにアポトーシス誘導能の調査を進めています。これらの研究結果に関しても、データがまとまり次第、随時報告いたします。 |
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図８ メシマコブ菌糸体の各分画成分によるDNAラダー
１：コントロール区
２：エタノール抽出区
３：熱水抽出区
４：4%NaOH抽出後pH6調整した沈殿物区
５：４の上澄み液をエタノール沈殿させた沈殿物区
６：24%NaOH抽出後pH6調整した沈殿物区
７：６の上澄み液をエタノール沈殿させた沈殿物区 |
コントロール メシマコブ菌糸体抽出成分添加後
図９ ギムザ染色による細胞形態の観察 |
[ 健康の科学No.16 きのこ健康読本５より抜粋 ]
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